Paolo es licenciado en Ingeniería Aeroespacial desde 1988 y doctor en Aeronáutica y Astronáutica desde 1989 por la Universidad Politécnica de Nueva York. Es licenciado en Ingeniería Mecánica por la Universidad de Florencia desde 1990.
Desde el 23 de octubre al 7 de noviembre de 2007 Paolo voló como especialista de la misión en el transbordador espacial Discovery en la misión STS-120 a la Estación Espacial Internacional. Durante su misión, bautizada, como Esperia, Paolo llevó a cabo una serie de experimentos sobre fisiología y biología humanas para la comunidad científica europea. También participó en actividades educativas.
En noviembre de 2008 Paolo Nespoli fue asignado a su segundo vuelo al espacio, la Expedición 26/27. Esta misión de larga duración a la Estación Espacial Internacional despegó el 15 de diciembre de 2010. Las tareas de Paolo como ingeniero de vuelo durante la misión MagISStra incluyeron experimentos científicos y demostraciones tecnológicas, así como actividades educativas.
Durante esta misión hizo amplio uso de Flickr y Twitter para comunicar sus actividades al público en general.